蟲草素對小鼠慢性哮喘模型支氣管平滑肌收縮的作用及機制研究

張旻¹  周新¹  唐亮²  余伯成²  李鋒¹  張杏怡¹

（1. 上海交通大學附屬第一人民醫院呼吸科，上海200080；

2. 上海國寶企業發展中心，上海200001）

【摘要】 目的 評價蟲草素及蟲草素與糖皮質激素聯合應用對慢性哮喘模型小鼠氣道平滑肌收縮的調節作用及可能機制。方法 將32只C57／BI6小鼠隨機分成對照組和慢性哮喘模型組，利用肌動描記儀比較p38蛋白激酶抑制劑SB239063(10^-6 M)、蟲草素(10^-6M)以及糖皮質激素地塞米松(10^-6 M)單獨或聯合孵育前、后由乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)誘導的支氣管收縮反應，同時應用蛋白印跡檢測支氣管組織中p38蛋白激酶和熱休克蛋白              27(heat shock proteins 27，HSP27)的磷酸化狀態。結果 模型組小鼠的支氣管收縮較對照組加重，有統計學意義。對照組和模型組p38蛋白激酶抑制劑SB239063孵育1 h后對Ach介導的收縮反應較空白對照組下降(P<0.05)，地塞米松單獨和地塞米松聯合蟲草素在模型組小鼠Ach誘導支氣管平滑肌收縮力的作用均較對照組降低(P<0.05)；地塞米松單獨和地塞米松聯合蟲草素孵育后，對照組和模型組小鼠支氣管組織p38蛋白激酶和HSP27磷酸化水平較Ach單純作用組降低，而且在模型組，使用蟲草素干預后p38蛋白激酶和HSP27磷酸化水平較Ach單純作用組下降(P值均<0.05)。結論　Ach誘導的離體支氣管收縮反應具有良好的可重復性，卵清白蛋白吸入可導致Ach誘導的支氣管收縮反應加重。糖皮質激素聯合蟲草素治療較糖皮質激素單獨治療更有效抑制Ach誘導的氣道平滑肌收縮，此種潛在的協同作用可能通過更大程度地抑制p38蛋白激酶信號通路為機制。

      支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種常見呼吸系統慢性疾病，發病率在世界范圍內持續上升，未來15～20年內，全球哮喘患者將由目前的3億升至4億，并由此引發嚴重的疾病相關經濟負擔。氣道高反應性(airway hyperresponsiveness，AHR)是指氣道的過度收縮，表現為氣道對一系列藥理、化學、生理性吸入刺激物(包括膽堿類、組胺、腺苷單磷酸、二氧化硫、冷空氣等)產生的過渡收縮反應。作為哮喘進展的危險因素，AHR與疾病的嚴重程度、肺功能降低程度相關，為評價藥物療效的重要終點指標之一。故深入研究氣道平滑肌的收縮機制對于認識、防治氣道平滑肌過度收縮即AHR有著重要意義。

      絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)屬于絲／蘇氨酸激酶家族，包括三個主要的蛋白激酶途徑，有研究表明其在乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)誘導的收縮反應中受到活化。并啟動其下游信號鏈參與氣道平滑肌的收縮。

      糖皮質激素(簡稱激素)是治療哮喘有效的抗炎和預防藥物，目前有關激素作用機制的研究多注重于抗炎作用，而抑制氣道平滑肌收縮效應的研究報道較少。蟲草素(3’-脫氧腺苷)是冬蟲夏草的主要藥理成分，我們既往研究表明其對于慢性哮喘的炎癥和氣道重塑有一定作用，而對于氣道平滑肌的直接作用了解很少。本研究旨在應用肌動掃描技術檢測不同濃度蟲草素、激素以及兩者聯合應用對離體支氣管收縮力的作用，以觀察蟲草素與激素對氣道平滑肌收縮力的直接作用以及有無協同作用，并通過對Ach誘導離體支氣管收縮后觀察激素和(或)蟲草素對于p38MAPK磷酸化水平的作用，探究上述信號通路在Ach誘導的平滑肌收縮的作用以及對于激素和(或)蟲草素治療的介導作用。

      AHR是哮喘發生發展的重要危險因素之一，與疾病的嚴重程度、肺功能降低程度相關。過去AHR僅被視為氣道炎癥的表象，故對其研究只關注于炎癥細胞、細胞因子、炎癥介質和免疫應答，而作為氣道收縮的效應器—氣道平滑肌關注較少。近年研究發現，氣道炎癥和AHR存在分離現象，即兩者并不一定并行存在，因此推測AHR可能獨立氣道炎癥或氣道炎癥發生之前即可存在。

      氣道平滑肌收縮的兩個基本特征是產生收縮力的能力和氣道收縮的速率，而后者取決于平滑肌收縮時所遇到的阻力負荷。因此，我們在進行肌動描記操作之前，首先以高鉀溶液獲得氣管平滑肌最大長度，在最大長度的基礎上檢測平滑肌收縮反應即收縮張力。氣道平滑肌收縮的另一個特點是它可因激動劑濃度梯度的增加而逐漸產生興奮、收縮，直到一個頂點即所有的受體均被該激動劑結合。這樣就產生一個劑量(Log對數)一反應的S形曲線，這個曲線的特征包括位置(靈敏性)、斜率(反應性)、平臺(最大反應值)。

      本實驗采用肌動描記技術和Ach梯度滴定，檢測離體支氣管的收縮反應、收縮張力。首先，我們檢測支氣管的收縮反應是否具有可重復性，我們的結果與Liu等的報道類似，即Ach誘導的離體支氣管收縮反應具有很好的可重復性，從而便于我們進行后續的實驗研究，其次通過對空氣組和OVA暴露組小鼠在Ach誘導支氣管收縮反應比較發現，OVA暴露小鼠可加重平滑肌收縮反應。

      p38MAPK受到環境應激、細胞因子(TNF-a、IL-1β)、內毒素、香煙煙霧、生長因子和共刺激分子等作用時，既可活化TNF-a，參與細胞分化、生長、凋亡、移行。p38MAPK抑制劑SB203580(而非ERK抑制劑PD98059)可抑制平滑肌收縮。Kwon和Lee等的研究證實，p38MAPK／HSP27(而非ERK)參與ET-1介導的自發性高血壓大鼠的主動脈收縮。最近，Ihara等的研究總結了p38MAPK途徑通過數種方式調節胃腸平滑肌收縮：①p38MAPK／HSP27可逆轉鈣調蛋白結合蛋白對肌球蛋白Ⅱ的Mg-ATP酶抑制效應；②p38MAPK通過磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亞基1而抑制MLCP活性，引發肌肉收縮。由于我們前期對于大鼠的研究提示蟲草素可能更多地依賴抑制MAPK家族的成員之一的p38MAPK信號通路中起效，因此本次對于小鼠氣道收縮的研究聚焦p38MAPK在蟲草素和(或)糖皮質激素介導的氣道收縮中的作用。我們的研究結果顯示分離的小鼠支管對Ach的最大等長收縮力受到p38MAPK抑制劑的抑制，表明p38MAPK參與支氣管平滑肌最大等長收縮反應。

      激素是在慢性哮喘中最常應用也是迄今為止最為有效的抗炎藥物，其通過與相關基因啟動子或增強子的激素反應元件相互作用，經轉錄活化誘導抗炎基因的表達，或直接與轉錄因子如NF-кB、APLl等結合，經轉錄抑制而下調炎性基因的表達。激素對激動劑引起的平滑肌收縮具有抑制效應。Sun等報道，布地奈德可在15 min內減少豚鼠的氣道平滑肌等長張力收縮。目前有關激素作用機制的研究多聚焦于抗炎作用，而其抑制氣道平滑肌收縮效應的研究報道較少。研究激素與氣道平滑肌的直接作用，有助于理解激素的作用機制。在本實驗中，激素孵育1 h即可抑制氣道平滑肌收縮力。因此我們推測，激素也有可能通過非基因組機制發揮作用。

       Linden研究發現胞外腺苷聚集是炎癥反應初始階段限制細胞損傷的機體防御性反應，是保護性的自分泌和旁分泌的信號傳導機制。腺苷和其他內源性物質在炎癥反應中適度激活抑制性信號傳導系統．其重要性在多種炎癥疾病中都已被證明(如敗血癥、類風濕一睢關節炎、動脈粥樣硬化和腫瘤等)。體外實驗證明腺苷能抑制中性粒細胞功能(如抑制其產生氧自由基、黏附血管內皮、損傷內皮細胞、吞噬作用等)，亦能抑制巨噬細胞產生炎性細胞因子，還能下調內皮細胞的活化(包括抑制細胞因子的釋放和黏附分子的表達)。腺苷在炎癥反應中的調節作用足通過AR介導，在前期結果發現蟲草素可能基于激活A2aAR而發揮潛在的抗炎作用，但在本實驗中，我們發現單獨應用蟲草素對于氣道平滑肌收縮力產生一定的收縮抑制作用，但僅在OVA組產生統計學意義，是否由于在OVA刺激下激活一定量A2aAR受體后方參與氣道平滑肌收縮力的抑制作用則需進一步研究，然而Dex聯合蟲草素治療則仍表現出一定的抑制氣道平滑肌收縮作用，而且效果似乎優于Dex單獨干預組，而對于p38MAPK/HSP27信號通路的抑制作用較激素單獨應用組有增大趨勢，但無統計學意義，因此兩者的協同作用有待于進一步研究。同時我們發現在哮喘模型的小鼠支氣管，與對照組相比較不論蟲草素單獨及和激素聯合應用都具有更強的抑制p38MAPK/HSP27磷酸化的作用，提示蟲草素可能對活化而非生理性的p38MAPK信號通路產生作用。 

       總之，我們的研究表明Ach誘導的離體支氣管收縮反應具有良好的可重復性，OVA吸人可 導致Ach誘導的支氣管收縮作用加重。p38MAPK信號通路參與Ach誘導的氣道平滑肌收縮反應，激素可有效抑制Ach誘導的氣道平滑肌收縮，而聯合蟲草素治療可使上述平滑肌收縮抑制能力進一步加強，激素聯合蟲草治療可能通過抑制p38MAPK/HSP27磷酸化水平發揮上述作用。

（摘自：《國際呼吸雜志》2012年第32卷第20期：1545-1551）