蟲草素對結(jié)腸癌細胞體外增殖、遷移能力的影響及其誘導(dǎo)細胞凋亡的作用

蔡 偉¹ 葉 青¹　唐 亮²　余伯成²　鄭民華¹

(1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院，上海200025；

2. 上海國寶企業(yè)發(fā)展中心，上海200001）

【摘要】 目的 研究蟲草素在體外對結(jié)腸癌細胞增殖、遷移能力的影響，及其誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用。方法　按血清藥理學(xué)實驗原則，將20只BALB/c裸鼠隨機分為兩組，分別喂飼蟲草素或生理鹽水，3d后處死取血清，將血清按下列不同處理方法在體外與人結(jié)腸癌細胞株SW1116共培養(yǎng)：(1)蟲草素組；(2)化療組；(3)蟲草素＋化療組（下稱：聯(lián)合用藥組）；(4)空白對照組（下稱：對照組）。以CCK-8法檢測細胞增殖抑制作用，Transwell小室觀察檢測細胞遷移能力，熒光染色和流式細胞檢測法觀察細胞凋亡情況。結(jié)果  (1) SW1116細胞經(jīng)蟲草素＋順鉑聯(lián)合作用96h、120h后，細胞增殖的抑制率顯著高于其余三組（P＝0.02）；(2)蟲草素聯(lián)合順鉑能顯著減少腫瘤細胞遷移數(shù)（P<0.05）；(3)經(jīng)Hoechst33258熒光染色，在聯(lián)合用藥組中見大量被染成亮藍色的凋亡細胞，流式細胞儀定量分析顯示該組細胞凋亡率明顯高于其余三組（P<0.05）。結(jié)論 蟲草素及鉑類化療藥（順鉑）對人結(jié)腸癌細胞株SW1116有顯著抑增殖、抗遷移和促凋亡作用，蟲草素與順鉑合用可顯著提高這一療效，提示蟲草素有一定的化療輔助作用。

蟲草素（Cordycepin）是北冬蟲夏草中最主要的生理活性成分。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為：冬蟲夏草性平味甘，入肺、腎二經(jīng)，“肺與大腸相表里”。研究顯示北冬蟲夏草具有提高免疫力和抗腫瘤的作用。但是冬蟲夏草的主要有效成分蟲草素是否同樣具有預(yù)防和治療結(jié)腸癌的作用及其作用機制引起廣泛關(guān)注。本研究運用血清藥理學(xué)的方法，給BALB/C裸鼠分別喂飼蟲草素或同體積生理鹽水后處死取血清，將各組血清分別或聯(lián)合順鉑在體外與人結(jié)腸癌細胞株SW1116共培養(yǎng)，研究蟲草素對結(jié)腸癌細胞的增殖、遷移能力的影響，及其誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用。

一、用“血清藥理學(xué)方法”研究蟲草素抗結(jié)腸癌細胞的意義

近年來，結(jié)腸惡性腫瘤的發(fā)病率與死亡率呈上升趨勢，歐美國家結(jié)直腸癌的發(fā)病率位列惡性腫瘤的第二位，在我國為第四位。據(jù)2005年上海統(tǒng)計，結(jié)直腸癌的發(fā)病率已高居惡性腫瘤的第二位。

       手術(shù)仍是目前治療結(jié)直腸腫瘤的主要手段。但近30年來療效提高并不顯著。由于大部分結(jié)直腸惡性腫瘤患者在臨床確診時已伴有腹膜轉(zhuǎn)移或其他重要臟器的微轉(zhuǎn)移，單靠擴大切除范圍難以改善預(yù)后。臨床常采用術(shù)后輔助化療為主的綜合治療方案，間或加用物理治療、靶向藥物和中藥，但中晚期患者的術(shù)后無瘤生存率和總生存率仍不令人滿意。約有50％的患者死于術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，有必要探尋新型輔助藥物以提高結(jié)直腸癌療效，改善預(yù)后。

       冬蟲夏草是我國的珍稀藥材，其具有提高免疫力和抗腫瘤的作用。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示：冬蟲夏草中最主要的生理活性成分為蟲草素和蟲草多糖（CP）。有研究顯示CP可以通過激活宿主免疫反應(yīng)而發(fā)揮抗腫瘤作用。另有研究顯示蟲草素和CP能夠促進人扁桃體及小鼠T-淋巴細胞的增殖，并且能夠促進環(huán)磷酰胺（CY）抑制鼠脾活化T細胞增殖；在一定濃度下，可以顯著升高人扁桃體活化T細胞TNF-β的分泌水平，這對增強機體抗腫瘤免疫功能具有很大的作用。但目前文獻報道的體外實驗大多將蟲草素或CP直接作用于離體細胞，這與臨床實際用藥以及藥物實際作用情況明顯不符。一般在臨床上患者口服用藥后，藥物需經(jīng)消化道吸收、經(jīng)血液運送到全身各部、再經(jīng)機體代謝和排泄，因此對腫瘤起治療作用的成分不一定是藥物的原形，它可以是經(jīng)代謝后的其他產(chǎn)物，也可以是藥物在體內(nèi)經(jīng)過許多中間環(huán)節(jié)引導(dǎo)機體產(chǎn)生的其他藥理反應(yīng)，為此我們根據(jù)血清藥理學(xué)的原則設(shè)計了本實驗：先給裸鼠喂飼蟲草素，讓藥物經(jīng)消化道進入機體，通過一定的代謝過程，使血液富含藥物有效成分，然后提取其血清，在體外將含藥血清和（或）聯(lián)合鉑類化療藥物作用于結(jié)腸癌SW 1116細胞，借以間接觀察蟲草素對腫瘤細胞增殖、遷移的影響及其誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。如此設(shè)計似較直接加藥法更符合臨床實際，更為合理。

      “血清藥理學(xué)”的概念和基本原理最早在1988年由日本學(xué)者田代真一提出，用于改進以前的不太合理的體外藥理實驗方法。事實上體外實驗是藥理的實驗研究中不可或缺的手段。其優(yōu)點是條件可控性強，可在細胞、亞細胞水平進行超微、生化、受體、基因等方面的研究，揭示藥物機制較為深入，重復(fù)性好，使用材料少。但隨著研究的深入，某些藥物直接加入離體反應(yīng)體系進行體外實驗的研究方法存在很多問題。由于某些藥物化學(xué)成分復(fù)雜，口服后體內(nèi)要進行一系列的生物轉(zhuǎn)化以發(fā)揮藥效，而且理化性質(zhì)復(fù)雜，經(jīng)常造成一些假陰性和假陽性的結(jié)果，例如：20世紀(jì)50、60年代國內(nèi)外用腫瘤細胞株在體外過篩數(shù)千種植物提取物，報道了上百個陽性結(jié)果，但用于體內(nèi)實驗結(jié)果大部分為陰性。這促使各國學(xué)者不斷努力，尋找更好的方法。1984年，在日本召開的第一屆和漢醫(yī)藥學(xué)會上，日本學(xué)者首次提出給動物灌服藥物一定時間后，取其血清進行實驗的藥理學(xué)新方法。1988年田代真一正式提出了“血清藥理學(xué)”這一新概念。此后，血清藥理學(xué)廣泛應(yīng)用于腫瘤、心血管、消化、免疫等方面的藥理學(xué)研究中，并與體外實驗所見作比較，取得了很大的進展。為此本研究應(yīng)用血清藥理學(xué)方法，進行蟲草素抗結(jié)腸癌的體外實驗。

二、蟲草素對結(jié)腸癌細胞抑增殖、抗遷移和促凋亡的作用

      人結(jié)腸癌細胞具有增殖快、易于向周圍組織浸潤及經(jīng)淋巴道早期轉(zhuǎn)移的特點，這是結(jié)腸癌導(dǎo)致患者死亡的重要原因。腫瘤細胞的遷移是造成腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素。有效地抑制腫瘤細胞增殖、減少細胞遷移，可以減少腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。本研究通過CCK-8細胞增殖抑制實驗發(fā)現(xiàn)，蟲草素組血清在作用于結(jié)腸癌細胞株SW1116 24h后出現(xiàn)顯著抑制細胞增殖的作用，但對細胞增殖的抑制作用不如傳統(tǒng)化療藥物順鉑明顯。蟲草素與順鉑聯(lián)合使用24～72 h，其對細胞增殖抑制作用與單純使用順鉑時相同，但當(dāng)96h后，聯(lián)合用藥組對細胞增殖的作用明顯強于單純化療組（P＝0.02）。提示早期、足量和長期應(yīng)用蟲草素能有效地抑制結(jié)腸癌細胞的增殖，這與黃浩等的研究一致。蟲草素不能替代順鉑。但蟲草素在長期應(yīng)用后有明顯的輔助化療的作用。

       Transwell小室法測定細胞遷移的實驗顯示，蟲草素能有效減少腫瘤細胞遷移的發(fā)生。蟲草素聯(lián)合順鉑后減少遷移發(fā)生的作用更為明顯，相比單純應(yīng)用順鉑組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。說明蟲草素能減少腫瘤細胞遷移的發(fā)生，聯(lián)合人體正常組織器官中，細胞的凋亡與增殖保持動態(tài)平衡，一旦平衡被打破，將導(dǎo)致細胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生。因此，誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡，有利于預(yù)防腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。本研究通過Hoechst 33258熒光染色定性研究，在蟲草素組中見到大量凋亡細胞，在聯(lián)合用藥組中似乎凋亡細胞數(shù)量更多。采用流式細胞儀法定量檢測細胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組細胞凋亡率顯著高于其他三組（P＜0.05），說明蟲草素聯(lián)合化療藥物有較強的誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用。這可能是其抑制腫瘤結(jié)節(jié)增大的原因之一。

       運用血清藥理學(xué)方法進行體外實驗，結(jié)果顯示，蟲草素能有效抑制結(jié)腸癌細胞株 SW1116的增殖、并有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抗遷移的作用；蟲草素聯(lián)合順鉑使以上的抑增殖、抗遷移和促凋亡作用更為明顯。

（摘自：《中華臨床醫(yī)師雜志》2011年第5卷第14期：4048-4054）