蟲草素及蟲草多糖對結直腸癌轉移的預防作用

和調控血管內皮生長因子表達的研究

蔡 偉¹ 葉 青¹　唐 亮²　余伯成²　鄭民華¹

(1. 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院，上海200025；

2. 上海國寶企業發展中心，上海200001)

【摘要】 目的  觀察蟲草素、蟲草多糖單獨用藥或聯合鉑類化療藥物對結腸癌轉移的預防作用以及對血管內皮生長因子(VEGF)表達水平的影響。方法  25只 BALB/c裸鼠經腹腔注射接種結腸癌細胞株 SW1116( 5×10⁶個細胞) 24 h后，分為蟲草素組、蟲草多糖組、順鉑化療組、聯合用藥組(蟲草素+順鉑)和空白對照組5組，分別予喂飼和(或)腹腔注射給藥。持續3周后，采用頸椎脫臼法處死裸鼠。觀察各組裸鼠的致瘤總數、腹腔內腫瘤結節直徑以及各臟器轉移情況。取腹腔腫瘤結節作病理切片，蘇木精-伊紅( H-E)染色后置于光學顯微鏡下觀察。應用透射電子顯微鏡觀察細胞超微結構，并檢測細胞凋亡狀況。采用免疫組織化學法觀察腫瘤細胞VEGF的表達情況。結果  順鉑化療組、聯合用藥組的腹腔內腫瘤結節數均顯著低于空白對照組(P值分別為0.007、0.001)，聯合用藥組與順鉑化療組間的差異無統計學意義(P> 0. 05)，蟲草組與蟲草多糖組間的差異亦無統計學意義(P> 0.05)。聯合用藥組腫瘤結節的直徑顯著小于其余4組(P值均< 0.05)，順鉑化療組腫瘤結節的直徑顯著小于蟲草素組及空白對照組(P值均< 0.05)，蟲草多糖組腫瘤結節的直徑顯著小于空白對照組(P= 0.01)。各組肝臟、腸系膜、腎臟及腸系膜轉移率的差異均無統計學意義(P值均>0.05)。光學顯微鏡觀察見聯合用藥組的腫瘤細胞較其余4組顯著減少，細胞偽足消失。透射電子顯微鏡觀察見聯合用藥組出現大量凋亡細胞。免疫組織化學檢測顯示，聯合用藥組VEGF表達陽性的面積比顯著小于其余4組(P值均<0.05)。結論  順鉑、蟲草素及蟲草多糖具有一定的減少腫瘤腹腔種植的作用，可能對結腸癌術后腹腔轉移復發有一定的預防作用，蟲草素與順鉑聯合用藥可加強這一作用。順鉑、蟲草素及蟲草多糖能抑制結腸癌細胞質中VEGF的表達，可能與其抑瘤作用有關。

      結直腸癌術后復發和轉移是導致患者死亡的主要原因 ,在接受結直腸癌根治性手術的患者中，仍有50%死于術后腫瘤復發和轉移。約有30%~ 40%臨床上難以檢測出轉移灶的患者已存在微轉移。因此,如何在術后早期進行藥物干預，減少腫瘤的轉移，已成為提高結直腸癌患者術后生存率的一個重要課題。

      已有研究結果證實,蟲草素及蟲草多糖對小鼠皮下移植 Lewis肺癌的原發灶生長和肺部轉移灶均有明顯的抑制作用；對雌性小鼠的腹水型肝癌皮下移植瘤生長有明顯抑制作用。但目前尚缺少針對結腸癌轉移的前瞻性隨機對照研究。本研究建立結腸癌細胞株 SW1116裸鼠腹腔播散模型,觀察蟲草多糖、蟲草素單獨用藥或聯合順鉑對結腸癌細胞在裸鼠體內播散轉移的預防作用,探討藥物在裸鼠體內對結腸癌細胞株的促凋亡作用,及其對腫瘤細胞血管內皮生長因子(VEGF)表達水平的影響。

      腫瘤轉移是導致患者死亡的主要原因，轉移過程為腫瘤細胞從腫瘤原發部位脫離，進入周圍的基質，進入循環或淋巴系統，黏附在血管內皮細胞壁并向血管外遷移，以及向遠處組織侵犯，血管增生，形成新的轉移灶。這一過程的機制非常復雜，涉及多種黏附分子、基質蛋白酶、細胞因子及相應的信號轉導機制和相關的基因改變。腫瘤細胞在轉移的早期必須依靠多種蛋白酶，尤其是基質金屬蛋白酶和尿激酶降解細胞外基質和基底膜。隨后，借助不同黏附分子作用產生的外力和自身的一些運動相關蛋白脫離原來的組織，侵入血管或淋巴管內并游向遠處器官和組織，此時黏附分子協助腫瘤細胞附壁并最終游出血管。腫瘤是否發生轉移，又與腫瘤細胞本身的特性及其宿主細胞間的相互作用有關。

      轉移癌細胞在循環系統及靶器官中面臨幾種命運，一是發生凋亡，二是處于休眠狀態，三是持續增殖。這由腫瘤細胞的生物學特性、機體的免疫狀態及宿主器官的微環境共同決定。相當一部分腫瘤細胞處于休眠狀態，即細胞周期停滯，腫瘤細胞的增殖與凋亡處于平衡狀態，表現為腫瘤不增大(或不進展)。當機體免疫力下降時，靜止的腫瘤細胞擺脫受抑制狀態而持續增殖，發展為臨床可見的腫瘤。因此，如能提高機體的免疫力，調節體內微環境，就能有效地減少休眠細胞的激活，抑制腫瘤的發展。蟲草素和蟲草多糖作為冬蟲夏草的主要有效成分，已被多項實驗證實能有效提高機體免疫力，但其對結腸癌細胞增殖與凋亡的平衡關系所起的作用，目前尚缺少相關的實驗研究。

      本研究成功建立了結腸癌細胞裸鼠腹腔播散模型。并在成瘤早期分別給予蟲草素、蟲草多糖或蟲草素聯合順鉑進行干預，觀察蟲草素、蟲草多糖對結腸癌腹腔轉移的抑制或預防作用。結果顯示，順鉑化療組及聯合用藥組的腹腔致瘤總數顯著少于空白對照組(P值均<0.05) ，聯合用藥組腹腔致瘤總數少于順鉑化療組，但差異無統計學意義(P>0.05)； 5組間腹腔各臟器的轉移率的差異均無統計學意義(P值均> 0. 05) ；聯合用藥組的腫瘤直徑顯著小于其余 4組(P值均<0.05)，順鉑化療組的腫瘤直徑顯著小于蟲草素組和空白對照組(P值均<0.05)，蟲草多糖組的腫瘤直徑顯著小于空白對照組(P= 0.01)。這一結果提示，蟲草素及蟲草多糖對腹腔內播散轉移的腫瘤細胞有較強的抑制增殖的作用，當與順鉑聯合應用時，這一作用更為明顯。

      本研究中，光學顯微鏡下觀察見聯合用藥組腫瘤細胞數較其余4組顯著減少，細胞偽足消失，細胞質減少，部分細胞出現核固縮、碎裂，該結果支持了上述觀點。透射電子顯微鏡觀察細胞超微結構發現，蟲草素組和蟲草多糖組中出現大量細胞核固縮、碎裂的凋亡細胞，聯合用藥組中凋亡細胞數尤為增多，順鉑化療組中較多見的是細胞壞死。觀察結果提示，蟲草素及蟲草多糖在調節腫瘤增殖及凋亡的平衡關系中，具有抑制增殖和促進凋亡的作用，可減緩腫瘤生長，降低腫瘤轉移的發生率。

      腫瘤微轉移的存在是臨床出現復發和轉移的先決條件，但最終僅有少數患者形成轉移灶。這是因為腫瘤轉移的另一個重要條件，即腫瘤細胞播散區局部必須有新生血管形成，這樣才能保證腫瘤細胞的血供，促使其形成一個轉移灶，細胞因子在新生血管的形成過程中起決定性作用。VEGF是目前已知作用最強的血管形成促進因子，作為旁分泌因子增加微血管通透性，誘導內皮細胞分裂、增殖、遷移，從而促進血管形成。另有研究結果表明，VEGF不僅作為旁分泌因子刺激血管內皮細胞增殖，同時還作為自分泌因子直接作用于腫瘤細胞自身的VEGF受體而促進腫瘤細胞生長。因此，蟲草素及蟲草多糖對腫瘤細胞增殖的抑制作用是否與 VEGF表達下調有關，尚待進一步的研究闡明。

      本研究采用免疫組織化學法檢測裸鼠腹腔種植腫瘤中 VEGF的表達，并通過 Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件對腫瘤細胞中VEGF的表達進行定量分析。結果顯示，聯合用藥組VEGF表達陽性的面積比顯著小于其余 4組(P值均<0.05)，蟲草素組和蟲草多糖組腫瘤細胞中 VEGF表達陽性的面積比與空白對照組比較，也有不同程度的下調。該結果提示，蟲草素及蟲草多糖能有效地下調腫瘤細胞中 VEGF的表達；至于聯合用藥組腫瘤直徑顯著小于其他 4組是否與這兩種藥物協同下調VEGF表達及抑制腫瘤細胞增殖有關，尚待進一步地深入研究。

      本研究結果顯示，蟲草素及蟲草多糖能有效地抑制裸鼠腹腔內播散的腫瘤的增長，其原因為：①促進腫瘤細胞凋亡；②下調腫瘤細胞中VEGF的表達。當蟲草素與順鉑聯合應用時的抑瘤效果尤為明顯，表明蟲草素有較好的化療輔助作用；但蟲草素與順鉑聯合應用并未降低腹腔內各臟器的腫瘤轉移率；聯合用藥后腹腔致瘤總數顯著減少，但與順鉑化療組間的差異無統計學意義，故不能排除這一減少致瘤總數的作用是由順鉑主導的可能，尚需增大樣本量進一步研究。

（摘自：《上海醫學》2011 年第34 卷第8 期：624-628）