蟲(chóng)草活力素對(duì)大鼠慢性支氣管哮喘模型氣道重塑作用初探

張 旻¹ 周 新¹ 唐 亮² 余伯成² 李 群¹ 張杏怡¹  張國(guó)清¹

(1. 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院呼吸科，上海200080；

2. 上海國(guó)寶企業(yè)發(fā)展中心，上海200001)

【摘要】 目的 對(duì)蟲(chóng)草活力素(簡(jiǎn)稱(chēng)蟲(chóng)草) 在大鼠支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘) 模型氣道重塑中的作用及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方法 50只Wister大鼠[6~8周齡， (200±20) g]，隨機(jī)數(shù)字表法分為陰性對(duì)照組(A)、慢性哮喘單純模型組(B)(卵清白蛋白系統(tǒng)致敏和反復(fù)激發(fā)) 、慢性哮喘+蟲(chóng)草50 mg/kg 治療8周組(C)、慢性哮喘+ 布地奈德(BUD) 8 周治療組(D)及慢性哮喘+BUD聯(lián)合蟲(chóng)草8周治療組(E)。肺組織切片HE染色觀察病理變化并檢測(cè)氣道管壁厚度，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)氣道轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因β₁(TGF-β₁)表達(dá)水平，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR 法檢測(cè)肺組織A2a腺苷受體(A2aAR)mRNA 表達(dá)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行組間分析, Mann-Whitney 檢驗(yàn)進(jìn)行組內(nèi)兩兩比較, Spearman 等級(jí)相關(guān)分析。 結(jié)果 ①HE染色顯示所有藥物干預(yù)組較單純模型組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、平滑肌肥厚及黏膜肺組織水腫等炎癥表現(xiàn)明顯減輕，以D和E組最為明顯；②5組氣道管壁厚度依次分別為( 9.89±2.09) 、( 21.72±3.16) 、( 14. 94±1.96) 、 ( 12.29±2.75)和( 12.25±2.32) μm²/μm， F = 31.37， P <0.0001，所有藥物干預(yù)組氣道壁厚度均高于對(duì)照組(C組、D組和E組與A組比較后的P值分別為0.0001、0.0524、0.0524) ， 且低于單純模型組(C組、D組和E組與B組比較后的P值均< 0.0001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， C 組氣道壁較D組和E組增厚， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.0232和0.0147)；③5組TGF-β₁表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性率分別為(2.08±1. 63) %、(29.37±5. 08) %、( 12.30±3.26) %、(10.78±3. 35) %及( 7.43±2. 84) %，F(xiàn) =86. 45，P < 0.0001，所有藥物干預(yù)組 TGF-β₁蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組(C組、D組和E組與A 組比較后的P值均<0.0001)，且低于單純模型組(C組、D組和E組與B組比較后的P值均< 0.0001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；E組較C組的蛋白表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義下降( P = 0.005 2) ； ④5組肺組織 A2aAR mRNA 表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度依次為( 0.35±0.06) 、( 0.27±0. 10)、( 0.52±0. 07) 、( 0.24±0.05) 及( 0.47±0.08) ， F =26.46， P< 0.0001，C組和E組A2aAR mRNA 表達(dá)高于A組( P值分別為0.0001及0.0007)、B組( P值分別為0.0002及0.0003) 和D組(P值均< 0.0001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，D組表達(dá)低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P = 0.0003)；⑤所有大鼠支氣管壁厚度與氣道 TGF-β₁蛋白表達(dá)存在正相關(guān)( r = 0.80，P <0.01)，而C組大鼠肺組織 A2aAR mRNA 表達(dá)和 TGF-β₁蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)( r =－0.68，P = 0.03)。結(jié)論 蟲(chóng)草對(duì)哮喘模型的氣道重塑具有一定的改善作用，其機(jī)制可能通過(guò)增加慢性哮喘模型大鼠肺組織 A2aAR mRNA 轉(zhuǎn)錄，抑制氣道 TGF-β₁的生成，從而減輕氣道重塑，且蟲(chóng)草與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于降低 TGF-β₁的表達(dá)具有潛在協(xié)同作用。

      支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)作為一種常見(jiàn)呼吸系統(tǒng)慢性疾病, 其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)持續(xù)上升。哮喘主要表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)與變異性較大的可逆性氣流阻塞, 目前認(rèn)為上述改變的主要成因在于氣道的持續(xù)性損傷和結(jié)構(gòu)異常, 即謂氣道重塑, 而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β₁(TGF-β₁) 是迄今發(fā)現(xiàn)在氣道重塑最強(qiáng)的促氣道纖維化因子。

      蟲(chóng)草活力素(簡(jiǎn)稱(chēng)蟲(chóng)草) 為北冬蟲(chóng)夏草的主要活性成分, 目前大量藥理學(xué)研究表明其具有耐缺氧、 抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能及抗肝纖維化等作用, 其作用靶點(diǎn)可能在于腺苷受體( AR)。本研究旨在通過(guò)觀察大鼠氣道中TGF-β₁的表達(dá)以及氣道中 ARmRNA 的轉(zhuǎn)錄變化, 對(duì)蟲(chóng)草在慢性哮喘氣道重塑中的干預(yù)作用及靶位進(jìn)行初步探索。

      哮喘的氣道重塑是由多種細(xì)胞、炎癥介質(zhì)、生長(zhǎng)因子參與下出現(xiàn)的不完全修復(fù), 由于尚無(wú)重塑過(guò)程完全依賴(lài)于慢性炎癥的令人信服的證據(jù), 因此有學(xué)者認(rèn)為氣道重塑可能與氣道炎癥并行, 并導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生和持續(xù)。氣道重塑主要表現(xiàn)為氣道壁增厚、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM) 沉積、氣道血管生成/ 血管重塑、氣道平滑肌增生、肥大及黏液腺增生和黏液性化生。雖然哮喘重塑與間質(zhì)性肺疾病所致肺纖維化的典型病理特征相似, 但由于哮喘氣道慢性炎癥主要為嗜酸粒細(xì)胞(EOS) 浸潤(rùn), 巨噬細(xì)胞與其他細(xì)胞增加很少或不增加, 因此又有其特殊性。其調(diào)控因素眾多, 包括生長(zhǎng)因子、T輔助細(xì)胞(Th) 1/ Th2 細(xì)胞因子失衡、 基質(zhì)金屬蛋白酶、 內(nèi)皮素、 前炎癥細(xì)胞因子以及趨化因子等。

       眾多研究顯示在生長(zhǎng)因子中, TGF-β₁可能是哮喘氣道重塑的主要調(diào)控因子, 而其亞型 T GF-β₁是成纖維細(xì)胞的化學(xué)誘導(dǎo)劑, 通過(guò)自分泌、 血小板衍生生長(zhǎng)因子途徑對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖發(fā)揮雙峰效應(yīng), 同時(shí)也是成纖維細(xì)胞膠原最有效的刺激劑。因此本研究以 TGF-β₁作為觀測(cè)指標(biāo), 結(jié)果顯示其表達(dá)水平與氣道管壁厚度呈正相關(guān), 再次印證了上述觀點(diǎn)。由于當(dāng)前吸入性糖皮質(zhì)激素仍是預(yù)防氣道重塑的首選治療, 故本研究以BUD作為陽(yáng)性對(duì)照藥物, 同時(shí)增加聯(lián)合治療組, 以觀察其是否存在協(xié)同作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用蟲(chóng)草治療較單純哮喘模型支氣管壁厚度顯著下降, 但仍差于糖皮質(zhì)激素治療組, 而糖皮質(zhì)激素單獨(dú)用藥和聯(lián)合蟲(chóng)草對(duì)于支氣管壁厚度改善無(wú)差異, 提示蟲(chóng)草雖可在一定程度改善氣道重塑, 但是較糖皮質(zhì)激素而言仍有差異。而對(duì)于TGF-β₁在肺組織的表達(dá)結(jié)果則顯示蟲(chóng)草和糖皮質(zhì)激素?zé)o治療差異, 且聯(lián)合用藥具有顯著的協(xié)同作用, 提示蟲(chóng)草對(duì)于 TGF-β₁ 具有良好的抑制作用, 而糖皮質(zhì)激素可能同時(shí)存在 TGF-β₁以外的作用途徑改善氣道重塑。

       有研究表明, 蟲(chóng)草可通過(guò)調(diào)節(jié)肺灌洗液中的細(xì)胞含量, 降低蛋白酶活性而對(duì)于由內(nèi)毒素引起的小鼠急性肺損傷具有保護(hù)作用, 并可通過(guò)對(duì)大鼠肺氣腫模型 Th1/ Th2 相關(guān)細(xì)胞因子平衡的糾偏作用改善氣道慢性炎癥, 但蟲(chóng)草在哮喘動(dòng)物模型氣道重塑中的作用目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏系統(tǒng)性研究的報(bào)道。

       蟲(chóng)草的主要藥效成分為蟲(chóng)草素, 即 3’-脫氧腺苷, Linden研究發(fā)現(xiàn)胞外腺苷聚集是炎癥反應(yīng)初始階段限制細(xì)胞損傷的機(jī)體防御性反應(yīng), 是保護(hù)性的自分泌和旁分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。腺苷和其他內(nèi)源性物質(zhì)在炎癥反應(yīng)中適度激活抑制性信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng), 其重要性在多種炎癥疾病中都已被證明( 如敗血癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化和腫瘤等)。腺苷在炎癥反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用是通過(guò) AR 介導(dǎo), AR 屬 G-蛋白耦聯(lián)受體超家族, 目前已發(fā)現(xiàn)4種亞型, 分別是 A1AR、 A2aAR、A2bAR 和A3AR[11], 其在支氣管肺組織中均有分布, 研究表明抗原吸入可降低哮喘患者痰液和血清中AR的表達(dá)。而其中A2aAR 活化可抑制多種炎性細(xì)胞的聚集和炎癥介質(zhì)的釋放已在多項(xiàng)研究中證實(shí)^, 故本研究以 A2aAR 作為蟲(chóng)草的推測(cè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行研究, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)哮喘模型組 A2aAR mRNA 的含量較正常對(duì)照組降低亦證實(shí)了上述觀點(diǎn)。本研究顯示蟲(chóng)草可增加 A2aAR mRNA 轉(zhuǎn)錄水平, 且在蟲(chóng)草組 TGF-β₁和 A2aAR mRNA 含量呈負(fù)相關(guān), 提示蟲(chóng)草可能通過(guò)A2aAR 的表達(dá)增加抑制TGF-β₁的生成, 從而減輕氣道重塑。而A2aAR 和TGF-β₁的表達(dá)在其他各組無(wú)相關(guān)性存在, 是否預(yù)示低于或等于生理狀態(tài)的 A2aAR 表達(dá)水平未參與TGF-β₁表達(dá)有待于進(jìn)一步研究。而且值得注意的是, 糖皮質(zhì)激素組 A2aAR 表達(dá)與哮喘模型組無(wú)差異, 且反較正常組降低, 提示糖皮質(zhì)激素對(duì)于哮喘氣道重塑可能未經(jīng)過(guò)A2aAR 途徑。結(jié)合對(duì)于氣管壁厚度的作用在糖皮質(zhì)激素和聯(lián)合治療無(wú)異, 預(yù)示A2aAR 途徑在哮喘的氣道重塑中可能具有一定但非最主要的作用, 這也可能可解釋為什么聯(lián)合治療對(duì)TGF-β₁表達(dá)具有協(xié)同作用。同時(shí)上述結(jié)果對(duì)糖皮質(zhì)激素依賴(lài)型哮喘的治療探索亦具有潛在的提示意義。

       總之, 本實(shí)驗(yàn)表明蟲(chóng)草可能通過(guò)增加慢性哮喘肺組織 A2aAR mRNA 轉(zhuǎn)錄, 抑制氣道T GF-β1的生成,從而減輕氣道重塑。由于 A2aAR 的升高在哮喘氣道重塑中可能具有一定但非最主要的作用, 因此蟲(chóng)草單獨(dú)使用對(duì)于氣道重塑的改善作用較糖皮質(zhì)激素有限, 但是聯(lián)合用藥對(duì)于對(duì)于降低 TGF-β1的表達(dá)具有潛在的協(xié)同作用。

（摘自：《國(guó)際呼吸雜志》2011年第31卷第9期：78-83）